服务介绍：

免疫荧光四标即利用酪胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification）即TSA技术，在同一张切片上对四种蛋白同时进行标记，从而可实现对多种蛋白空间定位，定性及半定量分析。

TSA技术主要原理为荧光标记的酪胺在二抗上偶联的HRP与H₂O₂的作用下变为活化的酪胺并附着在靶标周围的蛋白酪氨酸残基上，此结合是共价结合。而一抗与靶标、二抗与一抗之间是非共价结合。通过微波处理，非共价结合的一抗二抗被打断并洗脱掉，而共价结合的荧光酪胺依然附着在靶标周围，将靶标通过荧光标记显示出来。在检测第二个靶标时，相当于全新的一轮标记，无需考虑第二轮的抗体是否与第一轮的抗体产生交叉反应。只需改变不同种类荧光染料标记TSA即可实现多个靶标的标记。通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现双重或多重荧光染色

扫描的荧光图像可以用软件对阳性信号进行半定量分析，用数据去评价阳性的强弱。对于阳性为单个细胞表达的指标可以做阳性细胞相关参数的分析，对于阳性为成片表达的指标可以做阳性面积相关参数的分析。阳性细胞数量相关参数包含：各指标阳性细胞比率、阳性细胞密度、阳性强度。一次分析即可获取各指标阳性细胞数量相关参数的三个数值。阳性细胞数量相关参数均可用于评价阳性强弱多少，可根据需求进行选择应用。阳性面积相关参数包含：阳性面积比，阳性强度。一次分析即可获取各指标阳性面积相关参数的两个数值。阳性面积相关参数均可用于评价阳性强弱多少，可根据需求进行选择应用。

送样运输要求：

1、组织样本放置于10倍样本体积的通用型组织固定液中固定24h以上，常温保存运输石蜡包埋切片。切勿冷冻结冰，切勿固定时间过长。

2、石蜡切片常温保存运输。

3、荧光四标只能做石蜡包埋切片，不能做冰冻切片和细胞爬片。

实验流程：

石蜡切片脱蜡至水——微波抗原修复——画圈双氧水封闭——血清封闭——孵育第一种一抗——孵育HRP二抗——孵育iF555-TSA——微波处理——血清封闭——孵育第二种一抗——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——微波处理——血清封闭——孵育第三种一抗——孵育HRP二抗——孵育iF647-TSA——微波处理——血清封闭——孵育第四种一抗——孵育iF594荧光二抗——DAPI染核——自发荧光淬灭——抗荧光淬灭封片剂封片——扫描全景成像——数据分析。