服务介绍：

免疫荧光三重标记即利用抗原抗体特异性结合原理，在同一张切片上3个抗原进行同时标记，从而实现定位，定性，半定量的分析。

实验流程：

1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液I 10min-环保型脱蜡液II 10min-环保型脱蜡液III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ5min-蒸馏水洗。

2、抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定）

3、画圈, 双氧水封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，封闭内源性的过氧化物酶，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min

4、血清封闭: 切片稍甩干，滴加BSA，封闭30min。（一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭）

5、加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

6、加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

7、加CY3-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加CY3-TSA，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min

8、微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

9、加第二种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

10、加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

11、加FITC-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加TSA，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min

12、微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

13、加第三种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

14、加CY5标记的荧光二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的CY5标记荧光二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。孵育完后，玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

15、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

16、淬灭组织自发荧光：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。

17、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

18、切片置于扫描仪下采集图像:DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光.。CY5激发波长 608-648nm, 发射波长672-712,，CY5原本为正红色，为了与CY3区分开，我们设定为粉色光。

技术原理介绍：

主要原理是基于酪胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification），以下简称TSA技术。TSA是一种基于辣根过氧化物酶HRP的催化活性对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。技术主要原理为荧光标记的酪胺在HRP与H2O2的作用下变为活化的酪胺，附着在靶标周围的蛋白酪氨酸残基上。此结合是共价结合，而一抗与靶标、二抗与一抗之间是非共价结合，通过微波修复处理，第一轮的一抗二抗被洗脱，荧光标记的酪胺依然附着在靶标周围。在检测第二个靶标时，相当于全新的一轮标记，无需考虑第二轮的抗体是否与第一轮的抗体产生交叉反应。只需变化不同荧光标记即可实现多个靶标的标记。通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现双重或多重荧光染色

石蜡切片免疫荧光三标结果判读

DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光，粉光，绿光 。

送样运输要求：

样本放置于20倍样本体积的固定液中固定24h以上，常温运输送样。切勿固定时间过长，切勿冷冻结冰。荧光三标只能做石蜡包埋切片，不能做冰冻切片和细胞爬片。